蛋白质表面有些疏水基团，在裂隙内部疏水基团更多，在较大浓度的盐水体系中与疏水填料配基会有疏水作用而保留，在稀盐溶液中蛋白质被洗脱。

疏水色谱只能用于生物大分子的分离，不能用于小分子分离，常用于前几步工艺的初步分离和蛋白质复性中。疏水色谱上样量一般小于离子交换色谱而大于凝胶色谱；分辨率也是小于离子交换色谱而大于凝胶色谱。其特别之处在于上样时盐浓度可以很大，盐浓度越大，保留越大。

在以上所说疏水色谱使用的盐是指盐析性盐，如 (NH₄)₂SO₄,Na₂SO₄ 等。在这些盐的浓溶液中蛋白质溶解度减小，但稳定性增加。另一种盐叫盐溶性盐，如盐酸胍和硫氰酸盐，在这些盐的浓溶液中蛋白质溶解度增大，但稳定性减小，甚至可逆性失活。盐溶性盐不能用于疏水色谱流动相。

用于蛋白质制备的疏水介质的基质是琼脂糖。配基主要有丁基、辛基和苯基。