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蛋白质分离介质的选择(二)----配基及基质的选择

发布日期:2015-05-25阅读次数:2383

蛋白质分离介质选择要同时考虑两方面,一是配基,也就是选择色谱模式;二是选择基质,包括基质的种类和排阻极限的选择。

  根据目标产品与杂质的性质差异选择介质是介质选择的主要依据。选择了介质也就是选择了分离模式。

   目标产品与杂质在分子大小、等电点 pI 、不失活或可逆失活条件下的疏水性、与亲和配基的作用四种性质上的差异是介质选择的主要依据之一。产品与杂质某方面的性质有大的差异,就可用来做为分离方法选择的依据。目标产品与杂质分子大小差异大可用凝胶色谱分离;等电点 pI 差异大可用离子交换色谱分离;不失活或可逆失活条件下的疏水性差异大可用疏水色谱分离;与某个亲和配基有特异作用的可用亲和色谱分离。

   在凝胶色谱、离子交换、疏水和反相、亲和类色谱中,反相色谱一般容易使样品失活,常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析,不太用于制备;其他的色谱方法,只要条件选择合适,都可以得到高的活性回收率,可以用于制备分离。

   基质主要有 3 大类:聚多糖,如交联琼脂糖、葡聚糖基质;硅胶和多孔玻璃;有机聚合物(聚苯乙烯等)。

   由于目标产品限定在蛋白质,分子量比较大,用于小分子的小孔填料肯定不能用。因为,多孔填料的总的表面积,有 90~95% 是在孔内,球型填料的球面上的面积只占有 5~10% 。小孔填料的柱容量太小。

   大孔硅胶和多孔玻璃,与蛋白质生物相容性差,大孔硅胶价格贵,表面活性基团少,制备的填料会残留酸性的硅羟基,造成非特异性吸附。大孔有机聚合物疏水性强,与蛋白质生物相容性太差,不作亲水性处理无法用于蛋白质分离。

   交联琼脂糖、葡聚糖基质是最适合用于蛋白质分离的基质材料,这两类材料生物相容性好,无非特异性吸附,表面有大量羟基,可用于连接配基,制得各种填料。

   琼脂糖微球及其交联后的产品一般叫 4B  CL4B  4FF  6B  CL6B  6FF ,这些产品再键合上不同基团得到离子交换、疏水、亲和色谱填料。 4B  CL4B  4FF 制备时的糖浓度为 4% ,排阻极限为6  ~2000 万。 6B  CL6B  6FF 制备时的糖浓度为 6% ,排阻极限为 1  ~400 万。 4B  6B 耐压低; CL4B  CL6B 耐压稍高一点,仍很低; 4FF  6FF 耐压较高,使用压力可到 0.15  0.3MPa 

    葡聚糖是线形结构,用环氧氯丙烷交联成球。因糖浓度和交联度不同,得到不同排阻极限的微球。葡聚糖微球排阻极限范围小些,在使用时不同条件下柱体积会有较大的变化,已逐渐较少用于离子交换、疏水、亲和色谱,较多用于凝胶色谱。